Ein Genotyp

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9369 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Autosomal-rezessive Deletionen des gesamten Nephrocystin-1-Gens (NPHP1) führen zu einer abnormalen Struktur und Funktion der primären Zilien. Diese Deletionen können zu einer tubulointerstitiellen Nierenerkrankung, bekannt als Nephronophthise, sowie zu Netzhauterkrankungen (Senior-Løken-Syndrom) und neurologischen Erkrankungen (Joubert-Syndrom) führen. Nephronophthise ist eine häufige Ursache für Nierenerkrankungen im Endstadium (ESKD) bei Kindern und macht bis zu 1 % der ESKD im Erwachsenenalter aus. Einzelnukleotidvarianten (SNVs) und kleine Insertionen und Deletionen (Indels) wurden weniger gut charakterisiert. Wir verwendeten ein System zur Bewertung der Genpathogenität (GenePy) und einen Genotyp-zu-Phänotyp-Ansatz bei Personen, die für das UK Genomics England (GEL) 100.000 Genomes Project (100kGP) rekrutiert wurden (n = 78.050). Dieser Ansatz identifizierte alle Teilnehmer mit NPHP1-bedingten Erkrankungen, die von den NHS Genomics Medical Centers gemeldet wurden, sowie weitere acht Teilnehmer. Bei Patienten aus verschiedenen Rekrutierungskategorien, einschließlich Krebs, wurden extreme NPHP1-Gen-Scores beobachtet, die oft durch eine klare rezessive Vererbung gestützt werden, was auf die Möglichkeit einer weiter verbreiteten Krankheit als bisher angenommen hindeutet. Insgesamt hatten zehn Teilnehmer homozygote CNV-Deletionen, acht davon waren homozygot oder zusammengesetzt heterozygot mit SNVs. Unsere Daten zeigen auch starke In-silico-Beweise dafür, dass etwa 44 % der NPHP1-bedingten Erkrankungen auf SNVs zurückzuführen sein könnten, wobei AlphaFold-Strukturmodellierungsnachweise einen signifikanten Einfluss auf die Proteinstruktur belegen. Diese Studie legt nahe, dass SNVS bei NPHP1-bedingten Erkrankungen im Vergleich zu CNVs in der Vergangenheit zu selten gemeldet wurde.

Nephrocystin-1 (NPHP1) wurde zunächst auf Chromosom 2q13 lokalisiert, bevor in derselben Region eine beträchtliche homozygote Deletion gefunden wurde1. Saunier et al. und Hildebrandt et al. identifizierte NPHP1 innerhalb des minimalen Deletionsintervalls zusammen mit einem anderen Gen, MALL2,3. Beide stellten bei Patienten mit einer heterozygoten Deletion zusätzliche Einzelnukleotidvarianten (SNVs) in NPHP1 fest, jedoch nicht in MALL. Saunier et al. Später wurde nachgewiesen, dass das NPHP1-Gen von zwei invertierten 358 Kilobasen (kb) großen Low-Copy-Repeats (LCRs) flankiert wurde und dass diese beide einen kleineren LCR von 45 kb enthielten, der die Deletions-Breakpoints des Patienten enthielt4.

Das menschliche Chromosom zwei ist aus der Verschmelzung der Chromosomen zweier Vorfahren von Menschenaffen entstanden, und der Telomer-Telomer-Fusionspunkt liegt bei 2q13. Telomere haben mehrere Wiederholungssequenzen, die das Vorhandensein dieser LCRs erklären könnten5. LCRs kommen in 5–15 % des menschlichen Genoms vor und stellen einen Punkt dar, an dem durch nichtallele homologe Rekombination (NAHR) vermittelte Überkreuzung auftreten kann5,6. Diese ungleiche Überkreuzung führt zu strukturellen Variationen, einschließlich Kopienzahlvarianten (CNVs) wie Duplikationen, Löschungen oder Inversionen5.

NPHP1 ist an den verbindenden Flimmerhärchen in Photorezeptorzellen und an der Basis des primären Nierenziliums (bekannt als Übergangszone) der Nierenepithelzellen der Sammelrohre lokalisiert7,8. Primäre Zilien sind nahezu allgegenwärtige Sinnesorganellen, die aus der Zelloberfläche hervorstehen9. Mit NPHP1 assoziierte Erkrankungen werden daher als Ciliopathien bezeichnet10.

Die homozygote Deletion von NPHP1 ist die häufigste Ursache für Nephronophthise (20–25 % der Fälle)11,12,13. Nephronophthisis, was auf Griechisch „verschwindendes Nephron“ bedeutet, ist eine tubulointerstitielle Nierenerkrankung, die je nach Erkrankungsalter klassisch in drei Kategorien eingeteilt wird: infantil, juvenil und seltener jugendlich14. Die Ultraschalluntersuchung zeigt kleine bis normal große Nieren mit erhöhter Echogenität aufgrund von Fibrose und Verlust der kortikomedullären Differenzierung. Aufgrund des Verlusts von normalem Gewebe können sich später im Krankheitsverlauf kleine kortikomedulläre Zysten entwickeln14. Die infantile Form unterscheidet sich am deutlichsten von den anderen Formen mit Beginn im Uterus, Oligohydramnion und ESKD in den ersten beiden Lebensjahren, weist jedoch eher vergrößerte als normale oder geschrumpfte Nieren und eine weiter verbreitete Zystenentwicklung auf15. Juvenile und jugendliche Nephronophthise kann mit Polyurie und Polydipsie vor der Entwicklung einer chronischen Nierenerkrankung sowie einer Wachstumsverzögerung einhergehen14.

Zusätzlich zur Nephronophthise leiden 15 % der Patienten an Netzhautdystrophie (Senior-Løken-Syndrom) oder neurologischen Phänotypen (Joubert-Syndrom)16. Der Phänotyp der Netzhaut kann mild sein17. Das Joubert-Syndrom (JS) ist durch zerebelläre Ataxie, geistige Behinderung, Hypotonie und neonatale Atemstörungen gekennzeichnet18. Die Fehlbildung des Kleinhirns ist im MRT als sogenanntes „Molar Tooth Sign“ (MTS) erkennbar. Die Missbildungen sind bei Patienten mit NPHP1-Mutationen mit milderem JS weniger schwerwiegend als bei anderen Genursachen18,19,20.

Die homozygote Deletion von NPHP1 ist vollständig durchdringend und daher pathognomonisch für den Nephronophthisis-Phänotyp11,13. Es ist allgemein bekannt, dass Nephronophthisis eine der Hauptursachen für ESKD bei Kindern ist14. Neuere Daten von Snoek et al. identifizierten homozygote Deletionen in NPHP1 bei 0,9 % der ESKD21-Erkrankungen im Erwachsenenalter. Eine Person erreichte ESKD erst im Alter von 61 Jahren. 69 % der Patienten hatten zuvor eine andere Diagnose als Nephronophthise, tubulointerstitielle oder zystische Nierenerkrankung21. Obwohl im Zusammenhang mit Nephronophthise berichtet, sind kleine Insertionen und Deletionen (Indels) sowie Einzelnukleotidvarianten (SNVs) in NPHP122 weniger gut charakterisiert.

Während Einzelvarianten-Assoziationstests häufige Krankheitsvarianten erfolgreich identifizieren konnten, sind sie für seltene Varianten selbst bei hohen Fallzahlen immer noch unzureichend23. Wir haben daher unser Bewertungssystem auf Genebene, GenePy24, angewendet. GenePy ist eine Software, die Daten auf Variantenebene in Daten auf Genebene umwandelt. GenePy generiert eine Bewertung der Pathogenität des gesamten Gens für jede Person, indem es in silico Schädlichkeitsmetriken, Populationsallelhäufigkeit und beobachtete Zygotie für jede Variante einbezieht24. Die Wirkung mehrerer Varianten innerhalb eines Gens wird in einem einzigen kumulativen Genpathogenitäts-Score für jedes Individuum zusammengefasst. GenePy-Scores sind kontinuierlich, folgen jedoch keiner Normalverteilung. Höhere GenePy-Scores sind grundsätzlich intuitiv, da höhere Scores eine größere Belastung durch pathogene Mutationen aufgrund seltener und schädlicher Mutationen darstellen. GenePy-Scores können als Grundlage für die Priorisierung einer großen Anzahl möglicher Varianten verwendet werden.

Das UK Genomics England (GEL) 100.000 Genomes Project (100kGP), dessen Rekrutierung 2018 abgeschlossen wurde, zielte darauf ab, die Genome von Patienten mit Krebs und seltenen Krankheiten zu sequenzieren und diese Daten mit digitalen klinischen Aufzeichnungen zu verknüpfen. Ziel war es, die klinische Diagnose zu verbessern, Therapien anzupassen, neue wissenschaftliche Entdeckungen zu ermöglichen und die Forschung mit einem klinisch integrierten Dienst für genomische Medizin im britischen National Health Service (NHS) zu verknüpfen25.

Verwendung der Sequenzierung des gesamten Genoms und klinischer Längsschnittdaten aus dem 100kGP-Projekt; Unser Ziel war es, pathogene Variationen in NPHP1 und damit verbundenen Phänotypen mithilfe eines Genotyp-zu-Phänotyp-Ansatzes zu identifizieren. Wir haben GenePy-Scores für NPHP1 für alle Personen generiert, die für das 100kGP rekrutiert wurden, und außerdem Daten zur Kopienzahlvariation (CNV) einbezogen. Wir haben auch die Häufigkeit von CNVs und SNVs bei Personen abgefragt, die auf 100 kGP rekrutiert wurden, und die Beweise dafür bewertet, dass SNVs zum Phänotyp beitragen. Wir haben einen Gen-First-Ansatz oder einen Genotyp-zu-Phänotyp-Ansatz angewendet, indem wir die Genotypen aller für das 100kGP rekrutierten Personen unabhängig von ihrer Krankheit berücksichtigt haben. Anschließend führten wir eine umgekehrte Phänotypisierung durch, um das mit unterschiedlichen Mutationen verbundene phänotypische Spektrum in Beziehung zu setzen.

Das 100.000-Genom-Projekt wurde vom National Research Ethics Service Research Ethics Committee for East of England – Cambridge South Research Ethics Committee – genehmigt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Im Rahmen der ursprünglichen Studie wurde von allen Probanden und/oder ihren Erziehungsberechtigten eine Einverständniserklärung eingeholt.

Der Zugriff auf den GEL-Datensatz für das Projekt (Forschungsregister-ID 109) wurde von der Renal GEL Clinical Interpretation Partnership (GeCIP) genehmigt und alle Analysen wurden innerhalb der GEL-Forschungsumgebung durchgeführt. Patienten mit GEL-definierten Zulassungskriterien für seltene Krankheiten oder Krebs stimmten einer Keimbahnsequenzierung des gesamten Genoms in Verbindung mit klinischen Phänotypdaten, einschließlich longitudinaler elektronischer Gesundheitsakten, zu. Abhängig von der Rekrutierungskategorie des Teilnehmers wurden zum Zeitpunkt der Rekrutierung spezifische Daten zur Human-Phänotyp-Ontologie (HPO) erhoben26. Zu den weiteren longitudinalen Phänotypdaten gehörte die Datenbank „Hospital Episode Statistics“ (HES), die Einzelheiten zu allen Aufnahme-, Notfall- und ambulanten Terminen in NHS-Krankenhäusern in England enthält, die als ICD-10-Codes erfasst wurden27. Die Mehrheit der Teilnehmer stellte Blutproben zur Verfügung, obwohl eine kleine Anzahl Speichel für die Keimbahn-DNA-Extraktion zur Verfügung stellte. Zusätzlich zur Keimbahn-DNA stellten einige für den Krebszweig rekrutierte Teilnehmer auch somatische Tumorzell-DNA zur Verfügung.

Die Phänotypdaten wurden aus der vorläufigen Datenveröffentlichung v11.028 des LabKey-Hauptprogramms extrahiert. Die Bedingungen für die Human Phenotype Ontology (HPO) wurden von rekrutierenden Genomic Medicine Centers (GMC) gemäß dem GEL-Protokoll29 bereitgestellt.

Die genomischen Daten stammen aus einem aggregierten Multi-Sample-Variant-Call-Format (VCF; aggV2), Hauptversion 11 (17.12.20). Alle Proben wurden mit 150 bp Paired-End-Reads in einer einzelnen Spur eines Illumina HiSeq X-Instruments sequenziert. Die rohe Sequenzierungsausgabe in Form einer BCL-Datei (Binary Base Call) wurde mit dem Whole Genome Sequencing Workflow (NSV4, Version 2.6.53.23) von Illumina North Star Version 4 verarbeitet, der den iSAAC Aligner (Version 03.16.02.19) umfasst. und Starling Small Variant Caller (v.2.4.7). CNVs wurden von der Genomics England-Pipeline mithilfe der Illumina-Canvas-Software30 aufgerufen. Die Proben wurden mit Täuschungssequenzen an die NCBI Genome Reference Consortium Human Build 38-Assembly angepasst. Einzelproben-gVCFs wurden mit dem Illumina gVCF-Genotyper (v.2019.02.26) aggregiert.

Aus dem aggregierten gVCF wurde ein Multisource-gVCF extrahiert, aus dem der NPHP1-Genlocus (definiert mit NCBI GRCh38/hg38 (chr2:110,123,335–110,205,062)) mit bcftools 1.631,32 ausgewählt wurde.

Varianten, die Mindestqualitätsstandards erfüllen (GQ > 20, mittlerer GQ von > 35, DP > 10 und maximale Fehlen von 70 %), wurden mit vcftools 0.1.16 identifiziert und für die nachgelagerte Analyse aufbewahrt (n = 12.780)33.

Um Pathogenitäts-Scores für das gesamte Gen zu generieren, haben wir den GenePy-Algorithmus v.1.3 sowohl für kodierende als auch für nicht-kodierende Varianten angewendet24,34. Der GenePy-Score (S) für ein gegebenes Gen (g) und Individuum (h) ist die Summe der Wirkung aller Varianten (k), wobei jeder biallelische Varianten-Locus (i) in einem Gen entsprechend seiner vorhergesagten Schädlichkeit gewichtet wird (unter Verwendung von). CADD(Di), Zygotie und globale Allelfrequenz (gnomAD v3.0)) (f).

Die VCF wurde dann mit ANNOVAR 1.0 für gnomAD_version 3.0-Allelfrequenzdaten (f) und der RefGene-Gendatenbank35 annotiert. Combined Annotation Dependent Depletion (CADD) v1.6 wurde verwendet, um die Schädlichkeit zu kommentieren (D)36. Wir haben die Varianten auf solche mit CADD-PHRED-Werten über 15 (n = 214) beschränkt. Dieser Grenzwert wurde gewählt, da er den Medianwert für alle möglichen kanonischen Spleißstellenänderungen und nicht-synonymen Varianten in CADD darstellt.

Der GenePy-Algorithmus ist optimiert, um in VCF-Dateien dargestellte Indels und SNVs einzubeziehen, berücksichtigt jedoch nicht systematisch CNV-Daten. Daher wurde ein GenePy-Score für CNV-Deletionen des gesamten NPHP1-Gens in den Gesamtgen-Score integriert, indem (D) willkürlich als maximaler CADD 1,6-Score zugewiesen wurde, der für eine Stop-Gain-Variante innerhalb des NPHP1-Gens und der Allelfrequenz unter Verwendung der gnomAD-Strukturvariante v2 beobachtet wurde (f = 1,798 × 10–3).

Die identifizierten Mutationen wurden sowohl in der Missense 3D-Datenbank als auch mit Maestro Suite v13.1 und BioLuminate 4.6 Release 2022-1 (Maestro & BioLuminate, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2021)37,38,39,40,41 modelliert . Mutationen wurden anhand folgender Kriterien als pathogen identifiziert: (1) Die Substitution ersetzt einen vergrabenen geladenen Rest durch einen ungeladenen Rest, (2) die Substitution zerstört alle Seitenketten-/Seitenketten-H-Bindungen und/oder Seitenketten /Hauptkettenbindung(en) H-Bindungen, (3) Substitution bricht alle durch die gebildeten Seitenketten-/Seitenketten-H-Bindungen und/oder Seitenketten-/Hauptketten-H-Bindungen (4) Die Substitution führt zu einer Erweiterung oder Kontraktion des Hohlraumvolumens von ≥ 70 Å3, (5) die Substitution bricht eine durch den vergrabenen Wildtyp gebildete Salzbrücke. Die maximale NO-Bindungslänge beträgt 5,0 Å.

Der Genotyp-zu-Phänotyp-Ansatz, der SNVs, Indels und CNVs in die NPHP1-GenePy-Scores einbezieht, identifizierte renale, retinale oder neurologische Phänotypen unter den bestplatzierten Personen (siehe Tabelle 1). Das Alter bei Krankheitsbeginn wird wahrscheinlich überschätzt, da HES-Daten erst ab dem Datum der Rekrutierung verfügbar waren. Insgesamt wurden bei 26 Teilnehmern biallelisch-rezessive Genotypen identifiziert, die mit einer monogenen NPHP1-bedingten Erkrankung übereinstimmen. Unser Ansatz identifizierte achtzehn Patienten mit einem renalen oder retinalen Phänotyp und einem konstanten Genotyp bei der monogenen autosomal rezessiven Erkrankung. Die NHS-Zentren für genomische Medizin haben bereits acht davon gemeldet. Insgesamt wurden zehn homozygote CNV-Gesamtgendeletionen von NPHP1 entdeckt. Homozygote oder zusammengesetzte heterozygote SNVs, die mit einer monogenen Erkrankung vereinbar sind, wurden bei acht Patienten mit renalen, retinalen oder neurologischen Phänotypen identifiziert (siehe Abb. 1).

Bioinformatischer Arbeitsablauf mit Teilnehmerzahlen mit biallelischen Genotypen für monogene NPHP1-bedingte Erkrankungen. Der Vergleich des Genotyp-zu-Phänotyp-Ansatzes (Teilnehmer mit und ohne penetranten Nieren- oder Netzhautphänotypen) und den von der klinischen GEL-Pipeline gemeldeten Werten ist in Klammern angegeben. Dieser Ansatz war zum Zeitpunkt des Verfassens dieses Artikels vollständig auf die Aufnahme von Personen ausgerichtet, wie er durch die klinische Interpretationspipeline von GEL gelöst wurde.

Alle SNVs und Indels hatten Allelfrequenzen kleiner oder gleich 4 × 10−3 gemäß gnomAD v3.0 und CADD 1.6 PHRED-Scores zwischen 15 und 47 (siehe Tabelle 2). Die Bewertung der Pathogenität von Varianten erfolgte gemäß den Richtlinien des American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) und der Association for Molecular Pathology für die Interpretation von Sequenzvarianten42. Eine zeitliche Abfolge der GEL-Genomsequenzierung ist nicht verfügbar, und die Bestätigung bei Teilnehmern mit möglichen zusammengesetzten heterozygoten Mutationen erforderte eine Analyse der Elterngenome, sofern verfügbar. Allerdings müssen die zusammengesetzten heterozygoten Missense-Mutationen in-trans mit heterozygoten CNV-Deletionen sein, wohingegen homozygote Varianten keine Phaseninformationen erfordern. In drei Fällen war eine Beurteilung der Elterngenome hinsichtlich der Trennung von Kandidatenvarianten möglich. Teilnehmer neun war möglicherweise zusammengesetzt heterozygot für R668C und S666C; Beim Vater waren jedoch beide Varianten vorhanden, was das Vorhandensein in-cis bestätigte. Teilnehmer 33 war möglicherweise zusammengesetzt heterozygot für R545K und R444C; beide Varianten waren jedoch bei der Mutter des Teilnehmers vorhanden, was das Vorhandensein in-cis bestätigt. Es wurde bestätigt, dass zusammengesetzte heterozygote Varianten bei den Teilnehmern 14 (R639I und Y78H) mit einer Variante in jedem Elternteil getrennt sind. Es wurde nachgewiesen, dass es sich bei keiner Variante um eine De-novo-Variante handelte. Es wurde vorhergesagt, dass keine Varianten das Spleißen beeinflussen würden, darunter viele intronische Varianten mit mäßigen bis hohen CADD-Werten. Eine Liste dieser Varianten, einschließlich heterozygoter pathogener Varianten und solcher, die sich nicht trennten oder in ClinVar als harmlos galten, ist in den ergänzenden Daten enthalten (siehe Ergänzungstabelle 1).

Die CNV-Analyse ergab, dass bei 424/78.050 Teilnehmern aus 344 Familien (0,54 %) CNV-Deletionen in allen Krebs- und seltenen Krankheitskohorten festgestellt wurden. Die Allelhäufigkeit von CNV-Deletionen war in Kohorten mit Krebs und seltenen Krankheiten ähnlich und doppelt so hoch wie in gnomAD SV v2.1 beschrieben (siehe Tabelle 3). Letzteres ist möglicherweise nicht überraschend, da die exombasierte Sequenzierung für den Aufruf von CNVs eine größere Herausforderung darstellt.

Zehn homozygote CNV-Deletionen aus zehn verschiedenen Familien wurden in der Reihenfolge des absteigenden GenePy-Scores auf Platz zwanzig zusammengefasst. Sechs davon wurden von den GEL-Zentren für Genommedizin bisher nicht gemeldet. Acht Teilnehmer mit homozygoten CNV-Deletionen hatten Nierenversagen entweder mit ESKD (n = 6) oder CKD-Stadium 4 (n = 2). Das Alter bei der ersten Erfassung des Nierenphänotyps mithilfe von HES-ICD-10-Daten oder Rekrutierungs-HPO-Begriffen lag zwischen 6 und 52 Jahren. Vier Teilnehmer hatten eine Netzhautdystrophie, wobei das Alter bei der ersten Erfassung des Netzhautphänotyps zwischen 25 und 54 Jahren lag. Für einen Teilnehmer waren keine Daten zum Phänotyp verfügbar, er wurde jedoch wegen „unerklärlichem Nierenversagen bei jungen Menschen“ rekrutiert, was den Beginn einer ESKD vor dem 50. Lebensjahr erforderlich machte Ein Teilnehmer wurde wegen malignem Melanom in die Krebskohorte rekrutiert und litt im Alter von 52 Jahren an ESKD mit tubulointerstitieller Nephritis und hypertensiver Nierenerkrankung sowie im Alter von 54 Jahren an hereditärer Netzhautdystrophie. Alle zehn Patienten mit CNV-Deletionen wurden aufgrund der Prognose gemäß den Richtlinienstandards der ACMG als pathogen eingestuft Nullvariantencharakter der Gendeletion, was einen sehr starken Beweis für Pathogenität liefert.

Acht Teilnehmer hatten einen Phänotyp, der mit einer Nieren- oder Netzhauterkrankung und homozygoten oder zusammengesetzten heterozygoten SNVs übereinstimmte. Dazu gehörten eine homozygote Stop-Gain-Mutation (zwei Geschwister aus einer Familie), heterozygote CNV-Deletionen mit einer Missense-Mutation (zwei Geschwister aus einer Familie), zwei verschiedene homozygote Missense-Mutationen (zwei Individuen aus zwei Familien) und zwei verschiedene mögliche zusammengesetzte Heterozygoten Missense-Mutationen (zwei Personen aus zwei Familien). Bei den Teilnehmern mit homozygoten Stop-Gain- und homozygoten Missense-Mutationen und bei drei der zehn mit homozygoten CNV-Deletionen war Blutsverwandtschaft bekannt. Von diesen acht Geschwistern konnten die beiden Geschwister mit homozygoten Stop-Gain-Varianten aufgrund der Nullvariante gemäß den ACMG-Richtlinien als pathogen gemeldet werden. Bei den anderen SNVs handelte es sich um seltene (4.00E−04) oder neuartige Missense-Varianten mit starken In-silico-Beweisen für Pathogenität mit CADD-Werten zwischen 18 und 28,9.

Weitere acht Teilnehmer aus acht Familien hatten rezessive Genotypen, die mit einer monogenen NPHP1-bedingten Erkrankung vereinbar waren, jedoch keinen dokumentierten Phänotyp. Dazu gehörten sechs mit möglichen zusammengesetzten heterozygoten Missense-Mutationen und zwei zusammengesetzte heterozygote CNV-Deletionen in-trans mit einer Missense-Mutation. Ein Teilnehmer ohne dokumentierten Nieren- oder Netzhautphänotyp wurde in die Krebskohorte rekrutiert. Bei dem anderen handelte es sich um den Verwandten eines rekrutierten Teilnehmers mit einer geistigen Behinderung, für den keine Phänotypdaten für eine Nieren- oder Netzhauterkrankung verfügbar waren.

Es wurden viele heterozygote CNV-Deletionen (n = 414) entdeckt, darunter sechs in den Top 50 der GenePy-Rangliste. Bei den in die Krebskohorte rekrutierten Teilnehmern wurden zwei heterozygote CNV-Deletionen identifiziert, es wurde jedoch kein renaler oder retinaler Phänotyp erfasst. Die Deletionen waren jedoch in-trans mit einer intronischen Variante mit einem CADD 1,6 PHRED-Score von 15,56 und wurden in einer aktiven Enhancer-Markierung (H3K27ac) gefunden. Die verbleibenden heterozygoten CNVS wurden gemeinsam auf Rang 593 eingestuft und wiesen nach CADD 1.6 keine weiteren vorhergesagten pathogenen Varianten auf.

Um herauszufinden, ob die pathogenen oder vermuteten pathogenen Varianten (in Tabelle 2 beschrieben) einen Einfluss auf die strukturelle Integrität von NPHP1 haben könnten, haben wir die auffälligsten Änderungen im Strukturmodell von NPHP1 (UNIPROT#O15259) kartiert, das kürzlich von AlphaFold43,44 veröffentlicht wurde . Kurz gesagt, der AlphaFold-Algorithmus ist ein KI-System, das auf der Analyse von Kontaktkarten koevolutionärer Reste basiert, die aus mehreren Sequenzausrichtungen (MSAs) von Sequenzen extrahiert wurden und zwei neuronale Netze speisen: eines, das auf Strukturen der Proteindatenbank (PDB) trainiert wurde interatomare Winkel und Abstände vorhersagen; ein anderer, der darauf trainiert ist, die Geometrie und strukturelle Genauigkeit zu bewerten. Dieses Modell identifiziert fünf verschiedene Strukturregionen innerhalb der NPHP1-Polypeptidkette (siehe Abb. 2): eine N-terminale Domäne, die durch helikale Strukturen angereichert ist (Reste 1 bis 100, ungefähr), eine erste ungeordnete Region 1 (Reste 100 bis 150). ), eine SH3-Domäne (r.150 bis 210), eine zweite ungeordnete Region (210 bis 240) und eine globuläre C-terminale Domäne, die reich an Beta-Faltblättern und Alpha-Helices ist (240 bis 732). Die Qualität der Vorhersage ist in den meisten dieser Regionen im Allgemeinen konstant hoch, mit Ausnahme der beiden ungeordneten Regionen. Es liegen experimentelle Strukturdaten für die N-terminale Coil-Coiled-Domäne vor, wie die der Proteinfamilie der BAG-Domänen, von der bekannt ist, dass sie die anti-apoptotischen Funktionen vermittelt, und für die SH3-Domänen, von denen angenommen wird, dass sie an der Zelladhäsion beteiligt sind45,46.

Alphafold-Modellierung von NPHP1-Varianten. (A) Modell des NPHP1-Polypeptids, wie von AlphaFold vorhergesagt und manuell mit Anmerkungen zu den vorhergesagten Hauptregionen versehen. (B) Kartierung der von GenePy identifizierten Mutationen innerhalb des NPHP1-Strukturmodells. (C) Rückstand R683 und seine vorhergesagte Seitenkettenumgebung im NPHP1-Modell. (D) Rest W683 und sein vorhergesagtes Seitenkettengefolge im NPHP1-R683W-Mutantenmodell. In (C) und (D) sind H-Brücken als cyanfarbene gepunktete Linien dargestellt. (E) Mehrfachsequenz-Alignment, das die Konservierung von R683 in NPHP1-Orthologen (hauptsächlich Wirbeltieren) zeigt; Die Farbkodierung reicht je nach Grad der phylogenetischen Erhaltung von variabel (Cyan) und durchschnittlich (Weiß) bis hin zu konserviert (Kastanienbraun).

Das Strukturmodell von NPHP1 ermöglichte die Bewertung der Platzierung und der möglichen Auswirkungen auf die Struktur der identifizierten Mutationen sowohl mithilfe eines Missense-Prädiktors als auch mit Maestro Suite v13.1 und BioLuminate 4.6 Release 2022-1 (Maestro & BioLuminate, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2021)37,38,39,40,41. Erstens wurden alle Mutationen in vorhergesagten domänenhaltigen Regionen gefunden (ergänzende Abbildung 1B und ergänzende Tabelle 2). Zweitens wurde vorhergesagt, dass die meisten Mutationen keinen signifikanten Einfluss auf die Struktur haben – mit Ausnahme von M575T und R683W; Für M575T wird jedoch angesichts der Größenverringerung der Rückstände eine signifikante Veränderung des Hohlraums vorhergesagt (nicht gezeigt). Auch für R684W auf der anderen Seite umfassen die vorhergesagten Änderungen Folgendes: Diese Substitution ersetzt einen vergrabenen geladenen Rest durch einen ungeladenen Rest (TRP), unterbricht mehrere H-Bindungen mit den Resten P670, D621, Q619 und unterbricht eine gebildete Salzbrücke durch NE-Atom von R683 und OD1-Atom von D621. Zusammen mit einer Kontraktion von 90,504 Å3 (Ergänzungsabbildung 1C, D; Ergänzungstabelle 3). Schließlich bestätigten wir, dass R683 phylogenetisch konserviert war (ergänzende Abbildung 1E).

Bei achtzehn Teilnehmern wurden Genotypen identifiziert, die mit der Diagnose einer rezessiven NPHP1-bedingten Erkrankung und renalen oder retinalen Phänotypen übereinstimmen. Davon könnten zehn Teilnehmer mit homozygoten NPHP1-Deletionen gemäß den ACMG-Richtlinien als pathogen gelten. Acht Patienten hatten homozygote und zusammengesetzte heterozygote SNVs, darunter zwei heterozygote Varianten unsicherer Signifikanz (VUS) in-trans mit CNV-Deletionen. Von diesen können nur die beiden mit homozygoten Stop-Gain-Mutationen nach ACMG-Kriterien als pathogen eingestuft werden.

Bei den anderen SNVs handelte es sich um seltene (4.00E−04) oder neuartige Missense-Varianten mit starken In-silico-Beweisen für Pathogenität. Die CADD-PHRED-Werte lagen zwischen 18 und 28,9. Auf die Gefahr hin, einige ursächliche Varianten zu verlieren, haben wir einen CADD-Grenzwert von 15 und höher gewählt. Dieser Grenzwert wurde gewählt, da er den Medianwert für alle möglichen kanonischen Spleißstellenänderungen und nicht-synonymen Varianten in CADD darstellt. Varianten mit CADD-PHRED-Werten über 15 gehören voraussichtlich zu den oberen 0,5 % der schädlichsten Substitutionen, die im menschlichen Genom auftreten können. Allerdings können sie, wie auch Missense-Varianten in vielen anderen Genen, ohne teure und zeitaufwändige In-vitro- oder In-vivo-Funktionstests nicht offiziell als klinisch pathogen eingestuft werden. Dies stellt ein größeres Problem dar, da der Engpass bei der klinischen Interpretation nun von der Hochdurchsatz-Genomik zu einem Mangel an Hochdurchsatz-Funktionstests zur Bestätigung der Pathogenität führt. Da diese Varianten selten oder sogar nur einer bestimmten Familie vorbehalten sind, dürften die Kosten für die Entwicklung „gut etablierter In-vitro- oder In-vivo-Funktionsstudien“ unerschwinglich sein und zu einem Verlust des translationalen Nutzens für Patienten und ihre Familien führen. Wo funktionelle experimentelle Beweise verfügbar sind, unterstützen sie die Rolle einiger Proteindomänen bei Apoptose und Zelladhäsion45,46. Die AlphaFold-Strukturmodellierung dieser SNVs prognostizierte zusätzlich einen signifikanten Einfluss auf die Proteinstruktur.

Weitere acht Teilnehmer hatten einen rezessiven SNV-Genotyp, der mit einer monogenen NPHP1-bedingten Erkrankung übereinstimmte, aber keinen dokumentierten Nieren- oder Netzhautphänotyp. Einer wurde mit Krebs rekrutiert und drei waren „nicht betroffene“ Verwandte. Im Allgemeinen sind Phänotypdaten für Teilnehmer, die für Krebs rekrutiert werden, und für Teilnehmer an seltenen Krankheiten, die nicht der Proband sind, rar. Der GEL-Rekrutierungsprozess für Krebsteilnehmer erfordert nicht routinemäßig eine Dokumentation der Nierenfunktion, auch wenn diese ausnahmslos bei allen Patienten getestet worden wäre, die sich einer Krebsbehandlung unterziehen. „Nicht betroffene“ Verwandte ohne erfassten Phänotyp bei der Rekrutierung und ohne longitudinale ICD-10-HES-Daten könnten darauf zurückzuführen sein, dass sie entweder nicht klinisch untersucht wurden, an einer subklinischen Erkrankung leiden oder an einer klinischen Erkrankung leiden, die nicht dokumentiert ist, die sich später manifestieren kann oder nicht vollständig vorliegt penetrant.

Bei der Beurteilung der zusammengesetzten Heterozygotie besteht die Schwierigkeit darin, dass einige Varianten auf demselben Chromosom liegen können. Mit Short-Read-Daten, wie sie von Genomics England verwendet werden, kann dies derzeit nicht beurteilt werden. Wir haben das Vorhandensein von Transsexuellen bei einem Teilnehmer durch eine elterliche Beurteilung bestätigt. Ihr junges Alter erklärt möglicherweise den Mangel an Phänotypdaten für Probanden mit zusammengesetzten heterozygoten Varianten. Es kann sein, dass sie im Laufe ihres Lebens eine schwere Erkrankung entwickeln (zwei waren unter 15 Jahre alt). Array-basierte Daten zu homozygoten NPHP1-CNV-Deletionen von Snoek et al. deutet darauf hin, dass Personen möglicherweise erst im siebten Jahrzehnt eine Nierenerkrankung im Endstadium erreichen21. Um die Penetranz zu klären und andere Fälle zu bestätigen, ist eine longitudinale Nachbeobachtung dieser Teilnehmer unter Verwendung von HES-Daten von GEL erforderlich.

Die große Zahl der Teilnehmer am 100kG-Projekt bot eine einzigartige Gelegenheit, das gesamte Spektrum der pathogenen Variation bei NPHP1 und verwandten Krankheiten zu identifizieren. Wir haben daher einen objektiveren, agnostischeren Genotyp-zu-Phänotyp-Ansatz angewendet. Ein wesentlicher Vorteil gegenüber einem Fall-Kontroll-Ansatz besteht darin, dass die Notwendigkeit entfällt, Teilnehmer aufgrund der vorhergesagten Abstammung oder Verwandtschaft von Analysen auszuschließen. Dies ist besonders wichtig, da Individuen nichteuropäischer Abstammung in der genetischen Literatur unterrepräsentiert sind. Wie bei allen Ansätzen, die kurze Lesedaten implementieren, unterliegt dieser Ansatz den gleichen Einschränkungen. Dazu gehören eine verringerte Empfindlichkeit zur Erkennung von Varianten in stark variablen Regionen und das Fehlen einer Phasendarstellung. Ein Mangel an Phasendaten ist insbesondere bei Erkrankungen im Erwachsenenalter problematisch, bei denen die Eltern-DNA möglicherweise nicht zur Bestimmung der Zygotie verfügbar ist, was die Fähigkeit zur Beurteilung zusammengesetzter heterozygoter Varianten einschränkt. Wie bei allen großen Datenmengen hängt die GenePy-Bewertung von der Datenqualität und der Beseitigung systematischer Verzerrungen und technischer Artefakte ab. Die verwendeten Genomics-England-Daten waren jedoch von hoher Integrität, da alle Proben mit 150 bp Paired-End-Reads in einer einzelnen Spur eines Illumina HiSeq X sequenziert wurden.

Unsere Daten belegen den Nutzen eines Gen-First-Ansatzes, der die Identifizierung von Genotypen und damit verbundenen Phänotypen ermöglicht, die hinsichtlich ihres Phänotyps unvoreingenommen sind. Dieser Ansatz kann auf jedes Gen angewendet werden und schließt Teilnehmer ein, die möglicherweise noch keine Krankheit entwickeln. Bemerkenswert ist, dass beim Genotyp-Phänotyp-Ansatz zum Zeitpunkt des Schreibens keine Personen übersehen wurden, die von der klinischen Interpretationspipeline des GEL als gelöst gemeldet wurden. Den Daten des GMC-Ausstiegsfragebogens zufolge wurden neun Teilnehmer aus sieben Familien von GEL mithilfe der klinischen Interpretationspipeline gemeldet. Allerdings wurde eines für ein anderes Netzhautgen (PDE6B) als NPHP1 gemeldet. Dies unterstreicht die Möglichkeit, dass einige Teilnehmer mehr als eine monogene molekulare Diagnose haben. In einer gesamten Exomstudie mit 7374 Patienten wurden bei 101 (4,9 %) Diagnosen diagnostiziert, die mehr als einen Locus betrafen, und die damit verbundenen Phänotypen konnten unterschiedlich sein oder sich überschneiden47. Es war bekannt, dass alle Patienten mit mehr als einer genetischen Diagnose blutsverwandt waren.

Homozygote CNV-Deletionen von NPHP1 sind eine genau definierte Ursache für Nierenversagen. Allerdings ist der Beitrag von SNVs und Indels zu Nieren- und Netzhauterkrankungen weniger gut charakterisiert. Diese Studie legt nahe, dass pathogene NPHP1-Varianten häufiger vorkommen als bisher angenommen und dass SNVs bis zu 44 % der Diagnosen von NPHP1-bedingten monogenen Erkrankungen ausmachen können. Dies kann eine konservative Schätzung darstellen, da Teilnehmer ohne aufgezeichneten Nieren- oder Netzhautphänotyp (aufgrund ihres jungen Alters oder mangelnder Identifizierung) diese Phänotypen möglicherweise noch aufweisen.

Der Gen-First-Ansatz (Genotyp-zu-Phänotyp) in Kombination mit einem Genpathogenitäts-Score (GenePy) ermöglichte die Identifizierung des gesamten molekulargenetischen Spektrums von Nephrocystin-1 (NPHP1) im britischen 100.000-Genom-Projekt, unabhängig von Verwandtschaft oder Abstammung. Unterstützende Daten aus der AlphaFold-Strukturmodellierung legen nahe, dass bis zu 44 % der Diagnosen von NPHP1-bedingten Erkrankungen zusätzlich zu den gut beschriebenen CNV-Deletionen durch SNVs verursacht werden können. Es wird erwartet, dass die zunehmende Verfügbarkeit phasenweiser Genomdaten aus der Long-Read-Sequenzierung die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes steigert und eine sichere Bewertung zusammengesetzter heterozygoter Varianten ermöglicht. Längsschnitt-Follow-up wird Daten über die Fähigkeit liefern, zukünftige Krankheitszustände bei Personen mit hoher GenePy-Bewertung vorherzusagen.

Vollständige Daten sind im Genomic England Secure Research Environment verfügbar. Der Zugriff wird kontrolliert, um die Privatsphäre und Vertraulichkeit der Teilnehmer am Genomics England 100.000 Genomes Project zu schützen und die von den Teilnehmern erteilte Einwilligung zur Nutzung ihrer Gesundheits- und Genomdaten einzuhalten. Der Zugriff auf die vollständigen Daten ist Forschern nach der Registrierung bei einer Genomics England Clinical Interpretation Partnership (GeCIP) gestattet (https://www.genomicsengland.co.uk/about-gecip/for-gecip-members/data-and-data-access /) und durch Kontaktaufnahme mit dem entsprechenden Autor auf begründete Anfrage.

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Diese Forschung wurde durch den Zugriff auf die Daten und Erkenntnisse des 100.000-Genom-Projekts ermöglicht. Das 100.000-Genom-Projekt wird von Genomics England Limited (einem hundertprozentigen Unternehmen des Ministeriums für Gesundheit und Soziales) verwaltet. Das 100.000-Genome-Projekt wird vom National Institute for Health Research und NHS England finanziert. Der Wellcome Trust, Cancer Research UK und der Medical Research Council haben ebenfalls Forschungsinfrastruktur finanziert. Das 100.000-Genom-Projekt nutzt Daten, die von Patienten bereitgestellt und vom Nationalen Gesundheitsdienst im Rahmen ihrer Pflege und Unterstützung gesammelt werden. David Rinaldo für seine hilfreichen Ratschläge bei der Modellierung mit der Maestro- und BioLuminate-Suite (Schrodinger, NY). Analysen der Kopienzahlvarianten in NPHP1 wurden ursprünglich von Dr. Guillermo del Angel, Alexion Pharmaceuticals Inc., durchgeführt. Diese Studie wurde vom Southampton Biomedical Research Centre des National Institute for Health Research (NIHR) unterstützt. Die geäußerten Ansichten sind die der Autoren und nicht unbedingt die des NIHR oder des Ministeriums für Gesundheit und Soziales.

Eine Liste der Autoren und ihrer Zugehörigkeiten erscheint am Ende des Papiers.

University of Southampton, Duthie Building (MP 808), Southampton General Hospital, Tremona Road Shirley, Southampton, SO16 6YD, Großbritannien

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Gary Leggatt

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William Harvey Research Institute, Queen Mary University of London, London, EC1M 6BQ, Großbritannien

Boardman-Pretty F, Caulfield MJ, Henderson S, Jones LJ, Kasperaviciute D, Moutsianas L, Mueller M, Need AC, Patch C, Sosinsky A, ERA Thomas, Tucci A, Witkowska K; SM Wood

University of East Anglia, Norwich, Großbritannien

JN Griffin

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Die Analyse und Interpretation der gesamten Genomsequenzierungsdaten wurde hauptsächlich durch die von GL, GC, SN und SEGL erstellten Tabellen 1, 2 und 3 sowie die Ergänzungstabelle 1 durchgeführt. Das Fachwissen in Bezug auf Proteomik wurde durch die von LBR und JPALBR erstellten Ergänzungsabbildungen 1 und Ergänzungstabellen bereitgestellt 2 und 3. Die klinische Perspektive wurde von GL, CG und RDG bereitgestellt. Das Manuskript wurde von GL und LBR verfasst, mit Beiträgen aller anderen Autoren.

Korrespondenz mit Gary Leggatt.

JPA und LBR sind Aktionäre von Medetia Pharmaceuticals; JPA und LBR sind Autoren der Patentanmeldung WO2109/075369A1, die sich derzeit in der nationalen PCT-Prüfungsphase befindet. Es bestehen keine weiteren Interessenkonflikte.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Leggatt, G., Cheng, G., Narain, S. et al. Ein Genotyp-zu-Phänotyp-Ansatz deutet darauf hin, dass einzelne Nukleotidvarianten bei Erkrankungen, die mit Nephrocystin-1 (NPHP1) zusammenhängen, nicht ausreichend gemeldet werden (UK 100.000 Genomes Project). Sci Rep 13, 9369 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32169-4

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Eingegangen: 26. August 2022

Angenommen: 23. März 2023

Veröffentlicht: 09. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32169-4

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